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异戊烯醇是生物燃料中的一种，异戊二烯等商品化学品的前体。

现在已知在大肠杆菌中通过甲羟戊酸道路道路出产异戊烯醇，产量为理论最大值的70%。

本文基于甲羟戊酸二磷酸脱羧酶的混杂活性开垦基于IPP旁路的异戊烯醇路线。

一．MVA途径及不足

一分子MVA由两步磷酸化转变为一分子MVAPP，消耗两分子ATP，始末脱羧酶PMD天生一分子IPP，消耗一分子ATP，图。

综上通过MVA门路生产一分子IPP需要消耗三分子ATP，同时IPP水解时磷酸基团会被白搭，同时IPP积累会按捺大肠杆菌生长。

MVA途径因为异戊烯基二磷酸的毒性，及ATP的高需求量，提高产率。

二．IPP旁路途径

文章改进：本文改用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（PMD）的混杂活性开发基于IPP旁路的异戊烯醇途径。

采用异源表达酿酒酵母PMD酶脱羧MVAP酿成磷酸异戊烯基（IP」,此路线能够降低IPP毒性，并降低ATP的消耗，图「B」。

同时PMDsc对非天然底物MVAP的活性低，因而需构建PMD的突变菌株，提高活性。

三．构建筛选平台

将宿主菌株生长速率与PMD酶脱羧速率耦合，筛选PMD突变体。

方案：

1. 在培植基中添补MEP门路按捺剂Fosmidomycin，按捺MEP门路，阻断发作IPP和MAPP的唯一门路，图「B」。

2. PMDsc的杂沓酶活性，与IPP、二甲基焦磷酸烯丙酯DMAPP的造成相耦合。

3. 增加按捺MEP途径的抗生素消除内源性MEP途径爆发的IPP，只有异源IPP旁路的表达大肠杆菌本领发展。

步骤1：

对比报道中三种对IP有活性的激酶EcIPK、MtIPK、TaIPK在DH1菌株野生型中表达，对比得出MtIPK活性最高。

结论：优化了大肠杆菌DH1只能从由MVA道路旁路道路中产生的IPP中存活，验证了细胞滋长仅依赖于异源表达的IPP旁路中MVAP的脱羧反映。

(图a)

步骤2：

三种PMDsc突变体的动力学测定，R74H突变体活性最好，同时滋长速度最快。

结论：成长速率服从MVAP脱羧活性和PMDsc的表达程度而变化。

(图b)

四．筛选平台的应用

构建好举座筛选平台的底层菌株后，对PMDsc构建酶文库，验证多种分歧的PMDsc突变体在构建好的筛选平台前提下酶活性、菌株成长速度与产物滴度具有的关联性，「表2」。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2017.03.010

作者：祭