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江南大学刘龙老师团队以酿酒酵母为底盘菌株从头合成代糖甜茶苷和莱鲍迪苷，最终在15L发酵罐中从头合成1368.6 mg/L和132.7 mg/L的甜茶苷和莱鲍迪苷。

首先分为5个模块构建甜茶苷的生物合成途径，分别是：

①萜烯合成模块：引入Gibberella fujikuroi来由的 kaurene synthase「KS」、过表达MVA pathway的关头酶tHMG1和IDI1、引入法尼基焦磷酸合成酶的突变体FPSF112A，以镌汰对FPP的消耗，而FPP可用于合成其他对细胞滋长所得物质；

②P450s模块：引入Stevia rebaudiana来源的KO以及一种细胞色素P450s还原酶CPR1和Arabidopsis thaliana来源的KAH；

③甜茶苷合成模块：引入S. rebaudiana来源的两种UDP糖基转移酶UGT74G1和UGT85C2；

④UDP-葡萄糖合成模块；

⑤甜茶苷输出模块：经液相检测和质谱解析确定，工程菌株SGN06产生了4.5 mg/L的甜茶苷。

接着，找到限速步骤并消除：

①过表达P450s模块中的三种酶，发觉过表达KO使得甜菊醇steviol的产量提高91.3%；

②发觉KAH和CPR1含有跨膜组织域，当截短CPR1的TMD使得steviol滴度增加231.2%，而当截短KAH的TMD无法合成steviol；

③为优化底物运输通过短卵白接头融合表达这些酶，融合表达KAH-GGGGS3-trCPR1使得steviol产量最高达40.6 mg/L，此时将UGT模块基因整闭合去得到32.2 mg/L的甜菊苷，是初始菌株的7.2倍；

④为平衡内质网卵白合成负荷及其折叠本事，用更强的启动子取代其内源性启动子来过表达ER巨细调节因子INO2，甜菊苷滴度添加至67.7 mg/L。

之后，提高酵母宿主对甜菊苷的耐受能力：

①因为在胞外检测到产物，琢磨酵母质膜中没关系存在自动外排系统输出甜菊苷，通过将产物与Alpha Fold Protein Structure Database  「https://alphafold.ebi.ac.uk/」 数据库的转运卵白对接发现与ABC转运卵白的亲和力最高，通过质粒分歧过表达外排泵，发现过表达PDR11使甜菊苷的产量增补129.8%达155.6 mg/L；

②细胞应激响应调节没关系触发运送机制，并增补对真菌刻毒发酵条件的适应。在对六种不同的应激响应因子的考究中发现，MSN4的转录水平随着甜菊苷含量的增补而升高。当MSN4在菌株SGN08中运用质粒pY16-TEF1p过表达时，甜菊苷滴度增补了2倍，到达205.5 mg/L

但两种策略共同使用不能使产量更高，需要提高代谢通路流量。

末端，通过基因组规模的代谢模型对工程标的目的进行计算机预测：通过计算机模拟剖析敲除五个靶标，当GAL7被敲除时，甜菊苷滴度增加了19.4%达247.2 mg/L，阻断GAL7可能有利于葡萄糖-1-磷酸转化为UDP葡萄糖，这表明UDP葡萄糖浓度可能是SGN13中甜菊苷发生的限速因素，在敲除GAL7的菌株中过表达PGM2使甜菊苷滴度提高到302.1 mg/L

终极在15-L生物反响器中补料分趸批酵中表现最好的菌株甜菊苷滴度到达1368.6 mg/L，这是迄今为止到达的最高滴度。

本考究特殊详尽的描绘了构建工程菌株的基本思路和细致的策略，为我们设计和改造其他天然产品的生物合成途径提供了参考，对于限速步伐的辨别并怎样消除特殊模范，要多的融合计算机模拟等方式，为更多高附加值产品的合成助力。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30826-2

作者：巴图鲁